图1流程图总结的HILIC方法开发策略的每一个步骤。
步骤1：若分析物的性质是已知的，则选择两种合适的流动相pH值来进行筛选。若分析物的性质是未知的，则使用pH值为3.0，4.7，6.0（这些pH值是为了最大限度地提高选择性的差异）。
步骤2：在三种ACE HILIC固定相和特定的pH值下。使用表1中规定的等度或梯度条件来筛选样品。若在等度模式下保留时间过短或过长，则可能需要调整强溶剂（水）的百分比。若保留时间的间隙太宽，导致在等度洗脱时分离度过高（即一些分析物显示出比其他分析物更强的保留），则需要尝试使用梯度洗脱来得到理想的结果。同样地，若在梯度洗脱时分析物的峰太紧密。则可能需要尝试等度洗脱方法。基于以上数据，选择最佳的固定相/流动相组合来进行进一步的方法开发。
步骤3∶通过优化其他参数如柱温和缓冲液浓度等来进一步优化方法。一旦方法开发完成就可以按照需要评估稳定性。
什么是HILIC?
-亲水作用色谱（HILIC）的概念由Alpert首次提出
-HILIC非常适用于分离和保留极性物质。包括极性中性和极性离子化的分析物
-HILIC分离一般使用极性固定相和含有高有机溶剂的流动相
-HILIC的机理十分复杂（参见图2），其在固定相、流动相以及固定相-流动相界面的富水层之间为分析物提供多种相互作用模式
您何时需要考虑使用HILIC？
-HILIC能够保留和分离亲水性或RPLC无法充分保留的极性至强极性的分析物
-当亲水性或极性至强极性分析物的logP值（亲脂性测量值）约为零或更低时
-通常而言，若分析物在梯度洗脱RPLC中比咖啡因先出峰的，则适用于HILIC模式分离（图3）
